Hipertermofilinių archėjų viruso SIRV2 koduojamo baltymo P98 mutantų poveikio ląstelių energetikai tyrimai

Abstract

Šio darbo tikslas ištirti P98 baltymo bei jo mutantų raiškos E. coli ląstelėse poveikį ląstelių energetikai bei ląstelės membranų pralaidumui. Šis poveikis buvo vertinamas mikrobiologiniais, biocheminiais bei elektrocheminiais metodais. Mikrobiologiniais metodais tirtas ląstelių gyvybingumas po indukcijos IPTG, išsėjant ląsteles Petri lėkštelėse ir apskaičiuojant kolonijas formuojančių ląstelių skaičių mililitre (cfu/ml). Biocheminiu metodu buvo tirtas ATP kiekis ląstelėse. Šis metodas yra paremtas jonvabalio liuciferazės katalizuojama bioliuminescencine reakcija. Elektrocheminiais metodais deguonies elektrodu tirtas ląstelių suvartotas deguonies kiekis, o ląstelių sąveika su TPP+ jonais analizuota naudojant atrankų elektrodą. Sukaupto K+ ištekėjimas iš ląstelių vertintas kalio jonams atrankiu elektrodu. Remiantis gautais rezultatais buvo nustatyta, jog virusinio baltymo raiška neigiamai veikia ląstelių gyvybingumą bei metabolinius procesus. Baltymo bei jo mutantų raiška padidina E. coli ląstelių išorinės membranos laidumą, galimai sudarydamas pažaidas, kurios lemia greitesnį TPP+ jonų surišimą. Nė viena P98 baltymo mutacija nepadarė baltymo nenuodingu E. coli ląstelėms.

The aim of this study was to determine the effects of protein P98 and its mutants expression in E. coli on cell energetics and membrane permeability. Microbiological, biochemical and electrochemical methods were used in this study. Viability of the cells was evaluated using microbiological methods – counting colony forming units (CFU) on nutrient agar in Petri dishes. Membrane permeability of IPTG induced cells was monitored measuring TPP+ binding to the cells and intracellular K+ leakage using selective electrodes. Measurements of ATP content of the cells were based on ATP and luciferin-luciferase reaction. During this study it was determined that expression of P98 protein in E. coli cells causes negative effect on the cell viability and metabolic processes. Protein P98 and its mutants increase permeability of the cell envelope, probably damaging the outer membrane and leading to more efficient binding of TPP+ ions to the cells. All of the protein P98 mutants were toxic to E. coli cells.