Salmonella enterica bakterijų jautrumo ksenobiotikams tyrimai

Abstract

Šiuolaikinėje visuomenėje dėl netinkamai vartojamų antibiotikų susiduriama su antimikrobinio atsparumo problema – bakterijos pasižymi gebėjimu pašalinti antibiotikus bei kitas jai toksiškas medžiagas. Norint išvengti atsparumo sukeltų problemų yra kuriamos naujos vaistų molekulės, tačiau tai ilgai užtrunka, be to, šalutiniai poveikiai naujų vaistų nėra ištirti, todėl greitesnis kelias yra daugiavaisčio atsparumo (DVA) siurblių veiklos moduliacija. Šio darbo metu buvo siekiama nustatyti ksenobiotikų ir indikatorinių etidžio ir tetrafenilfosfonio katijonų sąveiką su laukinio tipo SL1344 bei AcrAB-TolC sistemos mutantinėmis padermėmis ir RND šeimos siurblių slopiklių 1-(1-naftilmetil)piperazino (NMP) ir fenilalanilarginil-beta-naftilamido (PAβN) poveikį šiai sąveikai. Nustatant naudotų medžiagų (ampicilino, chloramfenikolio, tetraciklino, EtBr ir TPP+) minimalias slopinančias koncentracijas buvo taikomas minimalios slopinančiosios koncentracijos metodas. Taip pat, buvo atliekami ir fluorescencijos matavimai kurie yra paremti etidžio bromido gebėjimu fluorescuoti susijungus su bakterijose esančia DNR. Buvo nustatyta, jog visiems tyrime naudotiems antibiotikamas atspariausia yra S. enterica L664 mutantinė padermė su padidėjusia siurblių raiška, o jautriausia ΔacrB mutantinė padermė. Naudoti slopikliai – NMP ir PAβN, padidina etidžio bromido kaupimąsi mutantinėse ΔTolC ir ΔacrB ląstelėse. Tuo tarpu naudojant TPP+ efektyvus tik PAβN, kuris padidina šio substrato kaupimąsi mutantinėse ∆acrB ląstelėse. Laukinio tipo ląstelėse, SL1344, abu naudoti slopikliai vienodai efektyvūs EtBr kaupime, o L664 ląstelėse NMP veikia šiek tiek efektyviau nei PAβN. Taip pat, nustatyta, kad PAβN geba išstumti etidį iš jo surišimo vietų DNR molekulėje kaip ir polimiksinas B. Polimiksino B poveikis laukinio tipo bei mutantinėms padermėms vienodas, tai reiškia, kad šis antibiotikas nėra DVA siurblių substratas naudotose ląstelėse.

Due to inappropriate using of antibiotics antimicrobial resistance occured – bacteria eliminate various antibiotics out of the cell so increased doses of drugs are needed. New drug molecules are being developed to avoid resistance problems, but this takes a long time and the side effects of new drugs have not been discovered, so the faster way to do is the modulation of multidrug (MDR) efflux pumps. The aim of this study was to determine the interaction of xenobiotics and indicatory ethidium and tetraphenylphosphonium cations with wild-type SL1344 and AcrAB-TolC system mutant strains and the effect of RND family pump inhibitors 1-(1-naphtylmethyl)piperazine (NMP) and phe-arg-β-naphthylamide (PAβN) for this interaction. The minimum inhibitory concentration method was applied to determine the minimum inhibitory concentrations of the substrates used (ampicillin, chloramphenicol, tetracycline, EtBr and TPP +). Also, fluorescence measurements were performed that are based on the ability of ethidium bromide to fluorescent upon binding to bacterial DNA. Results indicated that S. enterica L664 mutant strain with increased pump expression was the most resistant and the ΔacrB mutant strain was the most sensitive to all antibiotics used. Efflux pumps inhibitors – NMP and PAβN increase the accumulation of ethidium bromide in mutant ΔTolC and ΔacrB cells. Meanwhile, using TPP+, only PAβN is effective, which increases the accumulation of this substrate in mutant ∆acrB cells. In wild-type cells SL1344 both used inhibitors were equally effective in EtBr accumulation and in L664 cells, NMP was slightly more effective than PAβN. Also, it was found that PAβN displaces ethidiume from its binding sites in the DNA molecule like polymyxin B. The effect of polymyxin B on wild-type and mutant strains is similar, which proves that this antibiotic is not a substrate of MDR efflux pumps in S. enterica cells.