| Abstract: | Tyrimo tikslas. Įvertinti užląstelinio užpildo baltymų poveikį eozinofilų aktyvumui bei bronchų lygiųjų raumenų ląstelių ir plaučių fibroblastų proliferacijai sergant astma.
Tiriamųjų imtis ir metodai. Ištirta 19 alergine astma (AA) bei 12 sunkia eozinofiline astma (SEA) sergančių pacientų ir 15 sveikų asmenų (SA). Kraujo eozinofilai išskirti naudojant centrifugavimą aukšto tankio Ficoll gradiente ir magnetinę separaciją. Kiekvienam tiriamajam buvo sudaromos individualiosios kombinuotos kultūros tarp išskirtų eozinofilų ir plaučių struktūrinių ląstelių arba jų pagamintų užląstelinio užpildo baltymų (UUB). UUB išgryninti pritaikant ląstelių lizės metodą – amonio hidroksido pagalba yra suardoma ląstelinė kultūros dalis, tačiau lėkštelės dugne išsaugoma stabili nepakitusi UUB tinklinė struktūra. Eozinofilų adhezinės savybės įvertintos matuojant eozinofilų peroksidazės aktyvumą kombinuotose kultūrose; eozinofilų gyvybingumui vertinti naudotas fluorescencinis ląstelių dažymas; plaučių struktūrinių ląstelių proliferacija įvertinta naudojant Alamaro mėlio reagentą.
Rezultatai. Po 1 val. nuo kombinuotųjų kultūrų sudarymo, AA grupėje prie bronchų lygiųjų raumenų (BLR) ląstelių ir plaučių fibroblastų atitinkamai stabiliai prisitvirtino 78,1±2,0 proc. ir 81,2±2,3 proc. įpiltų eozinofilų, o prie jų išskirtų struktūrinių UUB – atitinkamai 89,0±1,0 proc. ir 89,6±0,7 proc. SEA grupėje atitinkamai 69,0±5,3 proc. ir 77,1±3,9 proc. bei 90,2±0,8 proc. ir 87,8±2,0 proc.; SA grupėje - 57,2±5,4 proc. ir 61,4±10,9 proc. bei 76,6±1,0 proc. ir 71,2±6,7 proc. Vertinant eozinofilų gyvybingumą po 24 val. inkubacijos mitybinėje terpėje be serumo, AA, SEA ir SA grupėse nustatyta 74,6±0,6 proc., 77,1±0,5 proc. ir 66,5±1,2 proc. gyvybingų eozinofilų. Sudarius kombinuotąsias kultūras su BLR ląstelėmis eozinofilų, gyvybingumas buvo reišmingai didesnis - atitinkamai 83,6±0,4 proc., 84,2±0,5 proc. ir 75,1±0,9 proc. Inkubacijos su plaučių fibroblastais poveikis eozinofilų gyvybingumui buvo panašus – AA grupėje gyvybingų eozinofilų kiekis patikimai padidėjo nuo 74,6±0,7 proc. iki 82,3±0,5 proc., SA grupėje - nuo 65,0±1,5 proc. iki 73,0±1,4 proc. (p<0,05). Išskirti UUB po kombinuotųjų kultūrų su SEA ir AA eozinofilais skatino plaučių struktūrinių ląstelių proliferaciją, atitinkamai BLR ląstelių skaičius po 48val. buvo 12,9±1,6 proc. ir 13,5±1,7 proc. didesnis (p<0,05), lyginant su BLR ląstelėmis, augintomis su eozinofilais nepaveiktais UUB, o plaučių fibroblastų - 7,8±1,2 proc. ir 7,9±1,2 proc. (p<0,05), tačiau SA grupėje patikimų pokyčių nustatyta nebuvo.
Išvados. Eozinofilai aktyviau adhezuoja prie UUB, negu BLR ląstelių, o sergant astma eozinofilų adhezijos intensyvumas prie UUB patikimai padidėja. Eozinofilų gyvybingumas padidėja sergant astma, o adhezija prie plaučių struktūrinių ląstelių skatina eozinofilų išgyvenamumą. Po sąveikos su eozinofilais pakitusi plaučių struktūrinių ląstelių UUB produkcija skatino jų proliferaciją sergant astma
Aim. To evaluate the effect of extracellular matrix proteins on eosinophil activity and pulmonary structural cell proliferation in asthma.
Methods. 19 allergic asthma (AA), 12 severe eosinophilic asthma (SEA) patients and 15 healthy subjects (HS) were included into the study. Blood eosinophils were isolated by using high density Ficoll centrifugation and magnetic separation. For each study individual combined cell cultures between isolated eosinophils and pulmonary structural cells or their released extracellular matrix (ECM) proteins were prepared. ECM protein purification was performed using ammonium hydroxide based cell lysis. Eosinophils adhesion was evaluated by measuring eosinophils peroxidase activity in combined cell cultures; Eosinophil viability was evaluated by fluorescent cell staining; Pulmonary structural cell proliferation was measured by Alamar blue assay.
Results. We observed that 78.2±2.0% and 81.2±2.3% of AA patients‘ eosinophils adhere to airway smooth muscle (ASM) cells and pulmonary fibroblasts, meanwhile 89.0±1.0% and 89.6±0.7% of eosinophils adhered to secreted ECM proteins. Similarly, 69.0±5.3% and 77.1±3.9% of SEA patients‘ eosinophils adhered to cells vs. 90.2±0.8% and 87.8±2.0% to secreted ECM proteins; in HS group – 57.2±5.4% and 61.4±10.9% vs. 76.6±1.0% and 71.2±6.7%. After 24h incubation in serum-free medium, we found that 74.6±0.6%, 77.1±0.5% and 66.5±1.2% of AA, SEA and HS eosinophils were viable, however, eosinophil viability in combined cultures with ASM cells was significantly higher - 83.6±0.4%, 84.2±0.5% and 75.1±0.9%. Incubation with pulmonary fibroblasts had similar effect – AA eosinophil viability significantly increased from 74.6±0.7% to 82.3±0.5%; in HS group - 65.0±1.5% significantly increased to 73.0±1.4%. ECM proteins, after incubation with SEA and AA patients‘ eosinophils, promoted pulmonary cell proliferation – ASM cells by 12.9±1.6% and 13.5±1.7%, pulmonary fibroblasts by 7.8±1.2% and 7.9±1.2% respectively, meanwhile HS eosinophils provided no significant effect.
Conclusions. Eosinophils adhere more intensively to ECM proteins than ASM cells, and this adhesion is further enhanced in asthma. Eosinophil survivability is increased in asthma, which is further enhanced after adhesion to pulmonary structural cells. Eosinophil affected ECM protein production increases pulmonary structural cells proliferation in asthma. |
